Sonhador de bom coração, Larry Daley (Ben Stiller), apesar se ser um azarado, sonha que o destino lhe reserva algo de grandioso. Mas nunca tinha imaginado que seria assim tão extraordinário, ao aceitar o que parecia ser um emprego menor como segurança nocturno no Museu de História Natural. Durante o turno de Larry coisas espantosas começam a acontecer… índios, gladiadores romanos e “cowboys” saiem repentinamente dos seus locais e travam batalhas épicas. Na sua busca pelo fogo, o Neandertal incendeia o seu próprio expositor; Átila, o huno, assalta os seus vizinhos do lado, e o T-Rex relembra a todos porquê que é o predador mais feroz da História. Durante o caos, a única pessoa a quem Larry pode pedir ajuda é à figura de cera do Presidente Teddy Roosevelt (Robin Williams), que ajuda o nosso herói a salvar o Museu.